引物对PCR反应的功能是绝对必要的。耐热DNA聚合酶在开始复制DNA之前需要对RNA引物进行退火。如果没有引物，DNA聚合酶就无法发挥作用，因此不会得到任何产物。

引物在任何DNA复制过程中都是必不可少的，在DNA复制过程中由引物酶合成在活的有机体内复制。对于PCR，针对特定基因的引物被人为创建并引入到样本中。只有当引物被结合时，DNA聚合酶才会被招募到复制位点。

对学生来说，最合乎逻辑的程序是首先使用PCR从人类基因组DNA中扩增HBB基因，引物末端有限制性内切位点(这将有助于连接到限制性内切酶消化的载体)。接下来，用酶切酶切表达载体，然后将酶切载体与扩增的HBB基因连接在一起。最终的产物将是原始载体的两个片段，在它们之间拼接HBB基因。

最合适的技术是PCR诱变技术。学生将设计引物，在期望的突变位点上不完美地退火。这些引物将包含插入新链的新的5碱基对序列。一次PCR扩增包含新突变序列和所有上游序列的片段。第二个PCR扩增包含突变序列和所有下游序列的片段。最后，PCR将从两个模板中扩增一个序列，使用用于扩增全长片段的原始引物。

聚合酶就是酶，酶在高温下往往会变性。如果使用正常的聚合酶，它会在每个高温阶段发生变性，这是将双链DNA分解为单链模板所必需的。通过使用热稳定聚合酶，酶不会变性，并且不需要在循环的每一步之后添加新的聚合酶。DNA链将继续被最初添加的热稳定聚合酶扩增。

热循环器用于完成PCR扩增。热循环器可以设置为根据反应体积在确定的循环量中循环变性、退火和伸展阶段。

热循环的步骤包括变性、退火和拉伸。

变性通常在94-98°C左右的高温下进行，使双链DNA的氢键断裂为单链。

退火是热循环的第二步，在50-65°C完成。这一步必须在足够低的温度下进行，以使引物附着在单链上，但又要足够高，以使杂交具有特异性。

热循环的延伸或延伸步骤用于允许DNA聚合酶创建模板DNA链的新的互补链。温度取决于所使用的DNA聚合酶，但一般范围为75-80°C。

在热循环阶段之前，如果需要，通常有一个热启动步骤来激活聚合酶。热循环阶段之后是最终延伸阶段和最终保持阶段。

初始化步骤或热启动发生在热循环之前，以激活DNA聚合酶。在95°C下孵育1至10分钟。使用需要热启动激活的DNA聚合酶的目的是防止非特异性扩增产物。

引物在退火步骤中开始与模板链结合。DNA链的延伸发生在热循环过程的后期。在热循环轮之后的最后一个延伸步骤中，DNA聚合酶对新链进行了腺苷酸化。DNA双链在热循环的变性步骤中断裂。

聚合酶链式反应的八个主要组成部分是:DNA聚合酶、缓冲溶液、引物、氯化镁、dNTPs(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶)、脱氧核苷酸三磷酸、DNA模板链、水和牛血清白蛋白(可选)。

PCR以指数方式增加DNA产物。双亲DNA链在第一个周期中分裂，扩增成2个DNA副本。第二个周期导致第一个周期的两个产物的放大。在第二个循环后，股的数量翻倍，得到4份拷贝。这种模式继续，放大的产品在每个周期翻倍。

第一周期:2份

第二周期:4份(2²）

第三周期:8份(2^3.）

第四周期:16份(2⁴）

第五周期:32份(2⁵）

这些答案都是多重PCR反应的特征。多重反应是指利用几组引物同时扩增DNA的几个不同目标区域。结合几种不同的引物组类似于在一个试管中进行多个PCR反应。其优点是使用的试剂较少，过程耗时较短。由于所有引物都在一个反应管中起作用，它们必须在相似的退火温度和相似的条件下进行优化。